Aspectos Específicos da Validação de Procedimento Analíticos para Resíduos de Praguicidas (agrotóxicos).

MANUAL DE GARANTIA DA QUALIDADE ANALITICA: RESÍDUOS E CONTAMINANTES EM ALIMENTOS

Objetivo: “instruir os laboratórios sobre como realizar um estudo de validação passo a passo e implementar procedimentos de garantia de qualidade de resultados, de modo a permitir uma avaliação objetiva de seu próprio desempenho e de seus métodos de ensaio”. Pág. 7.

Resíduos de praguicidas (agrotóxicos): “ disponibilizar informações minuciosas sobre a determinação desse analito de maneira concentrada, em uma única seção”. Pág.10.

“ A validação dos procedimentos analíticos, segundo os requerimentos deste manual, visa garantir a qualidade metrológica dos resultados analíticos, conferindo-lhes rastreabilidade, comparabilidade e confiabilidade”. Pág. 13.

Aspectos Específicos da Validação de Procedimento Analíticos para Resíduos de Praguicidas (agrotóxicos).

“Nesta parte trataremos das especificidades que devem ser prioritariamente observadas na validação dos procedimentos analíticos e durante as determinações de rotina do resíduo (praguicida)”. Pág. 85.

Os procedimentos analíticos multirresíduas são recomendáveis quando se trata de identificação e quantificação de resíduos em matrizes vegetais. Se o método for aplicado a mais de uma matriz, de um mesmo grupo ou de grupos distintos de produtos, seu credenciamento poderá ser solicitado apenas com dados da validação obtidos com a matriz representativa. Durante a rotina analítica, uma validação simultânea ou concorrente deve ser conduzida objetivando avaliar o comportamento do método para as demais matrizes do grupo componente do escopo, de forma a garantir que o método é aplicável de maneira integral a todas as matrizes que fazem parte do escopo.

 De maneira sistemática, os parâmetros que impactam na qualidade analítica precisam ser monitorados, de modo a garantir durante a rotina analítica que o método continua operando dentro de parâmetros preconizados. Se observada uma tendência significativa de desvio dos parâmetros, alguns procedimentos devem ser adotados no intuito de se identificar  e corrigir as causas prováveis do desvio.

- Matrizes Representativas

Critérios para a utilização de matrizes representativas:

1. No mínimo uma matriz representativa por grupo de produtos deve ser avaliada durante a validação, fato indispensável ao credenciamento de determinado procedimento analítico.
2. Quando um método for implementado na rotina para uma variedade de matrizes de um mesmo grupo, dados complementares deverão ser coletados de forma a consolidar a validação concorrente para todas as matrizes do grupo credenciado/ autorizado por intermédio da matriz representativa.

3. Na seleção da matriz representativa, devem ser utilizados os critérios  estabelecidos na tabela A.XI.1 ( CAC/GL 40-1993, Ver.1-2003),anexa.

4. Matrizes representativas podem ser utilizadas na validação  de métodos mono e multirresíduos.

- Analitos Representativos

Todos os analitos contemplados pelo escopo do método necessitam ser validados.

1. Preferencialmente, cada batelada de amostra a ser analisada deve ter uma curva de calibração contemplando todos os analitos do escopo do método. Na impossibilidade desse procedimento, a curva de calibração deve ser construída utilizando pelo menos o número mínimo determinado de analitos representativos.
2. A escolha desses analitos representativos deve ser feita muito cuidadosamente, de modo a prover evidência de que representa o escopo do ensaio. Dessa forma, a escolha deve ser feita de acordo com a probabilidade de se encontrar determinados resíduos na amostra e com as características físico-químicas dos analitos, optando-se pelos analitos mais críticos (e.g., com resposta mais crítica e variável).
3. O número mínimo de curvas de calibração dos analitos a serem determinados deve ser 15 analitos mais 25% do total envolvido  no escopo do método. Por exemplo, para um método que possui em seu escopo 100 analitos, a curva de calibração deve ser feita com pelo menos 40 analitos representativos.
4. Se o escopo do método for igual ou inferior a 20 analitos, então todos os analitos devem ser calibrados.
5. Sempre que uma substância ultrapassar seu LMR (não conformidade) e não fizer parte dos analitos representativos calibrados e dos estudos de recuperação de batelada, o resultado deverá ser considerado uma tentativa até a calibração deve ser feita, contemplando os analitos não conformes, além de um estudo de recuperação do analito na matriz da respectiva amostra.

- Validações (Requisitos Mínimos e Critérios de Aceitação)

A validação de procedimentos analíticos para determinação de agrotóxicos em matrizes de origem vegetal e animal deverá ser conduzida atendendo aos critérios mínimos dos seguintes parâmetros de desempenho:

1. Seletividade (interferentes);
2. Efeito Matriz;
3. Linearidade;
4. Recuperação/Veracidade;
5. Precisão (Repetitividade e Reprodutibilidade intralaboratorial);
6. Limite de Qualificação;
7. Limite de Detecção;
8. Robustez;
9. Incerteza de Medição.

- seletividade (Interferentes)

Analisar no mínimo seis amostras “brancas”, preferencialmente de seis fontes distintas, e verificar as possíveis interferências (sinais e picos no tempo de retenção em que se prevê a eluição do analito).

• Critérios de aceitabilidade

O sinal do interferente de ser < e igual a 30% do sinal na concentração do Menor Nível Calibrado.

- Efeito Matriz

Procedimentos de avaliação e critérios de aceitação do efeito matriz

Utilizando os dados obtidos dos experimentos de análise do analito em solvente e dos extratos / digeridos de matriz branca fortificada: aplicar o teste F (Fischer-Snedecor), de homogeneidade de variâncias, para verificar se as variâncias das amostras não matrizadas e matrizadas podem ser consideradas estatisticamente iguais, em cada nível i de fortificação.

Para tanto, aplicam-se os cálculos para cada nível i de concentração (fortificação), comparando-se amostras não matrizadas com aquelas matrizadas.

Curvas de calibração em solução só poderão ser utilizadas se demonstrada a ausência de efeito matriz.

- Linearidade

Construir uma curva de calibração com no mínimo cinco níveis de concentração, compreendendo os valores de LQ e preferencialmente o LMR, em cinco ou mais replicatas.

Calcular o coeficiente de correlação ou determinação e as percentagens dos resíduos individuais da curva.

• Critérios de Aceitabilidade

Os resíduos de regressão individuais não devem ser maiores que + ou -  20% em relação a resposta obtida na curva de calibração.

Quando esses pontos de aproximam ou excedem o LMR (Limite Maximo de Resíduo), esse valor não deve ser maior que + ou – 10%.

Um valor de resíduo, em cada nível, acima de tais limites pode ser rejeitado por um teste de outlier, desde que o coeficiente de correlação ou determinação permaneça dentro dos critérios de aceitabilidade do laboratório.

- Veracidade/ Recuperação e Precisão (Repetitividade e reprodutibilidade intralaboratorial)

Realizar a fortificação de, no mínimo, cinco replicatas de amostras em dois níveis de concentração: em um nível mais alto, preferencialmente no LMR.

Para a determinação da reprodutibilidade intralaboratorial (precisão intermediaria), repetir os procedimentos acima , no mínimo em mais duas ocasiões (em condições de reprodutibilidade).

Calcular as porcentagens de recuperação e coeficientes de variação (CV) das replicatas por nível de concentração.

• Critérios de Aceitabilidade

O procedimento analítico deve ser capaz de recuperar, em cada nível de fortificação e para cada matriz representativa, de 70% a 12% em média para todos os analitos, com uma precisão de CV < e igual a 20%.

Excepcionalmente, quando a recuperação é baixa, porém, consistente ( i.e., demonstra boa precisão) e a razão para isso é bem estabelecida (e.g. devido a distribuição do agrotóxico no processo de partição), uma recuperação abaixo de 70% pode ser aceitável. Entretanto, um método mais exato deve ser usado, se praticável.

A reprodutibilidade intralaboratorial deve ser < e igual 20%, excluindo qualquer contribuição devida a heterogeneidade da amostra.

- Limites de Quantificação

O limite de quantificação do procedimento analítico é definido como o nível mais baixo no qual foi demonstrado que os critérios de veracidade e precisão foram atendidos, desde que a relação sinal/ruído seja superior a seis (S/R>6).

- Limites de Detecção

Limite de detecção do equipamento é definido como a concentração do analito que produz um sinal de três vezes a razão sinal/ruído do equipamento.

Para determinar o limite de detecção, diluir o padrão, a critério do analista, até um nível de concentração detectável.

Injetar em triplicata e utilizar o valor médio.

Estimar a concentração correspondente a um sinal equivalente a três vezes o ruído.

- Robustez

A robustez do método deve ser demonstrada por intermédio de:

Estudos de pré-validação e otimização do método;

Monitoramento por intermédio dos resultados das amostras controle e verificação de desempenho do sistema.

 Outros estudos podem ser realizados, desde que devidamente embasados.

- Incerteza de Medição

A incerteza de medição deve ser estimada segundo procedimento estabelecido na seção 8 – Incerteza de Medição Analítica (IMA), da parte II, deste Manual.

• Critérios de Aceitabilidade

A incerteza de medição expandida (U) relativa deverá ser inferior ou igual a 50% (nível de confiança de 95%).

- Estudos de Estabilidade (Orientação Geral)

O estudo de estabilidade deve simular as condições nas quais o laboratório submete as amostras congeladas por 24 horas, ele deve provar a estabilidade dos analitos nas amostras nesse período, nas mesmas condições.

Os estudos de estabilidade podem ser realizados de forma concorrente aos ensaios de rotina.

- Extensões de Escopo (Novos Analitos)

Quando se desejar incluir novos analitos a um método previamente validado, o laboratório deve utilizar os mesmos parâmetros e critérios definidos anteriormente para garantir sua adequação (validação) após a inclusão.

De maneira alternativa, a validação de novo analito pode ser realizada de forma concorrente, por intermédio do uso de amostras de controle de qualidade durante as análises de rotina (e.g. com cada lote de amostras de rotina), um ou mais produtos de categoria são fortificados na concentração do LQ e em nível maior- preferencialmente próximo ao Limite Máximo de resíduo.

Determinar a recuperação e ocorrência de alguma interferência no branco de amostra correspondente.

Após a coleta de cinco dados por nível de fortificação, calcular a recuperação média e a reprodutibilidade intralaboratorial (CV), sendo que estes valores devem atender aos critérios descritos na validação.

- Calibrações Analíticas e Recuperação (Rotina Analítica)

Todos os procedimentos adotados na rotina analítica deverão ser respaldados pelos estudos de validação do método.

Todo resultado acima do LQ deve ser quantificado com o uso de curva de calibração e recuperação obtidas de uma matriz do mesmo grupo, preferencialmente da mesma matriz da amostra quantificada.

- Calibração Utilizando um Único Nível de Concentração

 A resposta da amostra necessita estar dentro de + ou- 20% da resposta padrão de calibração, nos casos em que LMR é ultrapassado.

Se o LMR não for excedido, a resposta da amostra deve estar dentro de + ou – 50% da resposta do padrão de calibração.

- Calibração por Interpolação de Dois Níveis de Concentração

Calibração deve ser feita em triplicata.

A diferença entre os dois níveis não pode ser maior que um fator 4.

As respostas médias, obtidas de determinações em replicatas para cada nível, devem indicar linearidade aceitável de resposta, com o maior fator não representando mais de 120% do mais baixo fator de resposta (110%, nos casos em que o LMR é alcançado ou excedido).

- Calibração Utilizando Três ou Mais Níveis de Concentração

Neste caso uma função de calibração pode ser utilizada para o calculo da concentração, dentro da faixa contemplada pelo maior e menor valor da curva de calibração.

A curva não deve ser forçada a passar pela origem.

A linearidade deve der definida pela inspeção visual do gráfico gerado pela regressão linear simples e / ou pela avaliação estatística dos resíduos de regressão, desde que o coeficiente de correlação ou determinação esteja dentro dos critérios de aceitabilidade preconizados.

Se algum resíduo de regressão, de cada nível de concentração, exceder + ou – 20% (+ ou – 10% no LMR ou acima dele), uma calibração alternativa deve ser utilizada. Geralmente, o uso de uma regressão linear ponderada é recomendado.

- Frequência Mínima de Calibração na Rotina Analítica

- Determinação da Recuperação na Rotina Analítica

Os níveis de fortificação para determinação das recuperações dos analitos deverão estar na faixa de calibração (e.g. no LMR), ou dentro de um nível de relevância para as amostras analisadas. Esse nível de fortificação deve ser alternado ao longo do tempo.

Sempre que possível, a recuperação dos analitos do escopo deve ser determinada em cada batelada de análise.

Entretanto, a frequência mínima aceitável é:

- Critérios  de Aceitação do Desempenho de Recuperação na Rotina Analítica

A recuperação média é calculada a partir de um grupo de produtos (diferentes de matrizes).

Limites aceitáveis para uma única recuperação média + ou – 2 x %DPR e podem ser ajustados usando dados de reprodutibilidade intralaboratorial (recuperação de rotina) ou repetitividade (validação inicial).

Entretanto, uma faixa generalizada de 60 a 140% pode ser usada na análise de rotina de multirresíduos. Recuperação fora dessa faixa usualmente requer reanálise do grupo, mas pode ser admitida em certos casos justificados. Todavia, recuperação consistentemente elevadas devem ser investigadas.

Se uma tendência significativa ocorrer na recuperação ou se resultados potencialmente inaceitáveis (DPRs maiores que mais ou menos 20%) forem obtidos, as causas devem ser investigadas.

• LMR: limite máximo de resíduo
• LQ: limite de quantificação

Referência: MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUARIA E ABASTECIENTO. SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUARIA. Manual de Garantia da Qualidade Analítica: Resíduos e Contaminantes em Alimentos. Brasília: MAPA/ACS, 2011. 227páginas. Pág. 89-97.